犬自身免疫性溶血性贫血的诊断

    自身免疫性溶血性贫血是由于犬体内产生自身抗体，与自身红细胞发生免疫反应，使红细胞大量破坏，引起的一种贫血性疾病。

摘要：
    自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia or AIHA)是由于犬体内产生自身抗体，与自身红细胞发生免疫反应，使红细胞大量破坏，引起的一种贫血性疾病[1]。AIHA的病因和发病机制迄今仍未完全阐明。目前对未能找到诱发因素的称为特发性或原发性AIHA，对有明确病因者称为继发性AIHA[2]。AIHA发病呈上升趋势，近几年笔者遇到很多AIHA病例。资料介绍确诊该病要做库姆斯试验，但兔抗犬球蛋白血清不容易获得，此试验开展很有难度。笔者用自身血清与自身红细胞反应诊断该病，简单易行，未见他人报道。现以最近接诊一病例为例，报告如下。

1  病史及临床症状 
    松狮犬，♂，7岁，24 kg，2月5号来我院就诊。主诉：2月2号发病，精神沉郁，全身无力，2月3号小便呈浓茶色，4号呈酱油色，绝食两天，近一个月来饮食、环境等均未改变，家里还有一7岁杂交母犬一切正常。临床检查：T：38.6℃、P：150次/min、R：65次/min，可视黏膜、皮肤苍白发黄，张口呼吸快速浅表，四肢无力。

2  实验室检查

2.1  血液眼观检查
    取抗凝血3滴，平铺在洁净载玻片上，于明亮处可见很多红色颗粒。
2.2  血常规检查

2.3  血清生化检查
    ALT：55U/L，AST：35U/L，ALP：62U/L，ALB：25.3，TP：76.4，DBI：12.4μmol/L，TBI：31.1μmol/L，γ-GT：3.6 U/L，AMYL：526 U/L，BUN：7.5mmol/L，CREA：83μmol/L，Ca：2.3 mmol/L，P：1.97 mmol/L，CK：65 U/L，LDH：132 U/L，GLU：6.1 mmol/L，CHOL：6.3 mmol/L，TG：0.65 mmol/L。

2.4  红细胞形态学检查
    鲜血悬滴镜检可见大量红细胞聚集成团。瑞氏染色镜检可见红细胞大小不均，大量球形红细胞，大量破裂红细胞，大量红细胞集聚成团，少量有核红细胞。煌焦油蓝染色镜检可见大量网织红细胞，约占成熟红细胞的45%。

2.5  自身红细胞与自身血清反应试验

2.5.1  抽血  抽患犬静脉血液5 ml。

2.5.2  分离血清  将2 ml血液注入一次性试管中静置并分离出血清。

2.5.3  分离少白细胞红细胞  将3 ml血液注入加有抗凝剂的一次性试管中，混匀，离心（条件设置：3500转/min，10min,温度4℃[3]），将红细胞与血浆交界处的白膜层与血浆一起去除，得到少白细胞红细胞。

2.5.4  过滤并洗涤红细胞  将少白细胞红细胞放入另一一次性试管中，加生理盐水5 ml，混匀，用一次性袋式输液器的网式药液过滤器过滤，离心，去上清液，再加生理盐水5 ml 稀释混匀，再过滤，如此往复5次。最后一次去上清液后加1 ml 生理盐水混匀，获得单个洗涤红细胞液。获得的洗涤红细胞液手工计数为2.55×1012/L。

2.5.5  做对照组 
    取我院健康献血犬血液5ml，按上述方法分别获得血清和洗涤红细胞液。将洗涤红细胞液用生理盐水再稀释，稀释后的洗涤红细胞液红细胞手工计数为2.80×1012/L。

2.5.6  自身红细胞与自身血清反应试验  取洁净载玻片4片，分别标注患1、患2、健1、健2。患1、健1分别滴患犬、健康犬的血清、洗涤红细胞液各100 ul并混匀，患2、健2分别滴患犬、健康犬的血清50ul、洗涤红细胞液100 ul并混匀。并将4个载玻片放于38.5度无菌培养箱中静置并计时。每5分钟镜检一次。

2.5.7  试验结果

   （注：按下列标准记录反应强度：－：红细胞均匀分布无凝集；+：25％红细胞凝集；++：50％红细胞凝集；+++：75%红细胞发生凝集。）
    患犬无可查发病诱因；血常规显示严重贫血；镜检网织红细胞、有核红细胞比例增高，红细胞再生良好；镜检有破裂红细胞、红细胞聚集成团，生化总胆红素、间接胆红素升高，临床症状茶色、酱油色尿，红细胞出现溶血；自身血清、红细胞出现凝集现象；其它脏器生化指标正常，其他临床症状正常。综合以上确诊为犬原发性自身免疫性溶血性贫血。该犬经治疗无效，于15日晚死亡。

3讨论
    1.该病诊断要明确以下问题：有无贫血，什么性质的贫血，是否存在自身抗体与自身红细胞发生免疫反应。
    2.笔者遇到的几个病例，血液中均有集结成团的红细胞，试验时，一定要过滤血液并获得单个红细胞溶液。一次性袋式输液器的网式药液过滤器，孔径为15um±2um（红细胞直径为6.6-7.7 um[4]），用它过滤较为理想。
    3.用过滤、洗涤后的红细胞与自身血清反应诊断自身免疫性溶血性贫血，笔者还没看到相关报道。该试验简单易行，随时可以做，治疗过程中，还可及时了解血清与红细胞凝集加重还是减轻，更能准确的对疾病的预后做出判断。
    4.对有自身抗体与自身红细胞明显凝集时，用上试验简单方便，对有自身抗体但不产生凝集或凝集不强时，上试验敏感性低甚至检验结果阴性，需要做库姆斯试验。
    5.库姆斯试验要用兔抗犬球蛋白血清，但兔抗犬球蛋白血清不容易获得，该试验很受限制。即使可以做该试验，对有红细胞出现凝集的血液也要过滤，如果不过滤，就无法判断凝集颗粒是血液中的还是试验中形成的。笔者所查到的有关库姆斯试验的资料都没有介绍要过滤及过滤的具体方法。

参考文献：
[1]胥洪灿, 郑小波, 聂奎, 等. 犬猫疾病诊疗学 [M]. 重庆: 西南师范大学出版社, 2006, 239.
[2]李文益. 自身免疫性溶血性贫血研究进展 [J]. 中华妇幼临床医学杂志, 2008, 4（3）: 1-4.
[3]赵冬梅, 张艳华, 李广庆, 等. 用去白细胞血液制备洗涤红细胞方法改进的探讨 [J].临床血液学杂志: 输血与检验, 2008, 21(3)：318.
[4]魏泓. 医学实验动物学 [M]. 成都: 四川科学技术出版社, 1998. 190.