犬冠状病毒感染现状及预防

摘要：
    犬冠状病毒在我国宠物临床中检出率较高，但临床兽医对其是否需要免疫存在一定的争议。本文从犬冠状病毒的流行性及其最新的变化，发病及免疫机理等几方面进行了综述，希望能对宠物临床免疫有所指导。

关键词：
    犬冠状病毒 检出率 发病机理，免疫
    Key words: Canine coronavirus, detective rate, pathogenesis, immunity
    Abstract：Canine Corona virus (CCV) is highly detected in small animal practice
in China, however there are different opinions about vaccination CCV for dogs.
The prevalence, lates transformation, pathogenesis, and immune mechanism about
CCV are discussed in the article.
    冠状病毒(Coronavirus)是近些年来媒体曝光率非常高的一种病毒。无论是2002年的“非典型性肺炎”还是2012年WHO就新发现的新型冠状病毒感染患者向全球发出警告，都与冠状病毒有关。犬——作为人类最忠实的伴侣也会感染冠状病毒，然而对于犬冠状病毒（CCV）有人认为临床病例很少见；其症状轻微无需特别关注；还有人认为它是一个不需要接种疫苗的传染病。
冠状病毒令世人如此瞩目，如此迷惑，到底是一种什么病原体呢？冠状病毒又称为日冕病毒，略呈球形，直径80-160nm。有囊膜，其表面覆盖有12-24nm的纤突，纤突末段呈球形，整个纤突之间保持较宽的间隙整齐规则的排列成皇冠状（见图1），故此命名。其膜表面蛋白S（刺突糖蛋白）在免疫过程中具有重要作用[1]。

    图1，冠状病毒模式图（摘自N Engl J Med 348;20 pp.1949）
    冠状病毒最早分离于鸡，可感染多种动物包括啮齿类、牛、猪、兔、猴、猫、犬、人和鸟类等，对胃肠道，呼吸道和神经系统具有广泛的侵袭性2。目前发现其包括3个抗原群，其中犬冠状病毒（CCV），猫传染性腹膜炎病毒和猫肠炎冠状病毒等宠物相关的都属于Ⅰ抗原群。基因学上将CCV分为Ⅰ和Ⅱ两类。
    CCV作为犬常见的急性传染病，在临床上症状各不相同。但不同品种，年龄，性别的犬只都可感染。通常表现为肠炎症状，包括呕吐、腹泻（典型特征为桔色恶臭粪便）、厌食、精神沉郁等，但通常比犬细小病毒（CPV）感染症状轻且死亡率较低，因此不太被宠物医师或主人所重视，但实际上CCV给宠物带来的危害或许要高于人们的想像。

1  CCV在犬只中的感染率
    调查显示，CCV在犬只中感染率非常高。犬冠状病毒自1971年首次在美国军犬粪便中检出，随后在世界其它各地都有报道，在国内1985-1990年徐汉坤，刘海涛，王允海分别报道了警犬，军犬CCV的感染3。但CCV引起的疾病至今未得到充分的调研，其在胃肠炎中扮演的角色细节还不太清楚。最近二三十年来的人们更多将注意力放在CCV毒株的基因变化及鉴定新型基因型或新型CCV上。CCV目前全球仍呈地方性流行。Tennant流调发现英国数个犬场CCV 血清阳性率高达76%～100% ,粪便病毒分离率为43 %4。2001年Mochizuki等采用PCR方法检测腹泻与正常犬粪便，两者CCV阳性率分别为57.3%和40%。用基因学方法从日本腹泻犬检测或分离出16%或57%的CCV，澳大利亚采用血清学方法检测腹泻犬发现85%对CCV-IgM抗体呈阳性反应，提示其被感染过5。1999-2005年不同研究者采用RT-PCR方法检测腹泻犬粪样发现犬肠炎型冠状病毒感染率在15-42%，在犬舍该感染率高达73%6。
    在我国张伯强等对38份腹泻粪样作CCV和CPV双项检测, CCV阳性16例(42.1%)。温海对40份发病死亡的肠道病料和收集的137份各地犬群粪便样品进行CCV检测，发病死亡犬病料CCV阳性率为20%。昆明，沈阳，南京健康犬群粪样中CCV阳性率分别高达93.1%、87.2%、73.1%。王玉燕等收集家养腹泻犬粪样52份，犬场群养健康犬粪样81份，腹泻粪样5份用巢式PCR方法检测发现：健康群养犬粪样86.4%检出CCV-Ⅱ；腹泻病犬粪样阳性率平均为49.1%7。张晋对北京临床犬调查发现CCV感染率为20%。
    对于临床表现正常的犬只仍能检测到CCV，表明动物已感染过CCV5。由此可见CCV感染广泛存在于家养和群养犬中。

2、CCV的致病性

2.1 CCV单独感染可导致严重致死性疾病
    CCV仅有一个血清型[8]，长期以来被多数人认为仅引起轻微的临床症状，从而一直未被引起足够的重视。从上世纪90年代末期开始，日本、澳大利亚、意大利等地的报道显示CCV具有比以前更强的毒力[9]。2005年意大利发生高致病性CCV感染。7只6-8周龄的幼犬发病，症状很像CPV感染，持续发烧（39.5-40℃）、精神萎靡、厌食、呕吐、血样腹泻和出现神经症状，全身症状出现后2天内死亡，白细胞数量降至正常水平的一半。内脏器官多处损伤严重。除用RT-PCR的方法检测到CCV外，未见其它常见病原体（图2）[10]。同年Evermann等也报道了两例7-8周龄的幼犬因严重肠炎死亡（图3），电镜和免疫组化检查仅发现CCV而未见CPV（图4）[9]。2006-2008年英国PDSA宠物救助医院47家分院收集355份严重腹泻犬粪样，发现CPV，CCV感染率居前两位，分别占58%和7.9%。虽然CCV合并CPV感染的发生率仅占2%，但死亡率CCV，CPV分别为21.4%， 30%，其它原因不清的占25%，死亡率差异并不显著[6]。这些结果与以前广泛认为的CCV仅引起轻微的临床症状，死亡率远低于CPV感染的结果有明显差异。同样类似的致死性冠状病毒病在法国和比利时也有报道。肠道以外组织分离到的CCV可能与其在胃肠道的局部扩散或者病毒血症有关，但尚未从血液中分离到病毒[11]。高致病性CCV的出现可能与不同CCV毒株之间出现分子杂交和遗传信息的增减有关。已有人分离出引起高致病性的Ⅱ型CCV感染[10]，但在患犬中CCV-Ⅰ和Ⅱ都可检出，中国和欧洲Ⅱ型检出率更高[7，12]。

    图2. 采用特异性单克隆抗体免疫组化的方法在犬肺脏检测到的CCV抗原（箭头所指位置）(摘自Canio Buonavoglia et al. 欧洲传染病杂志, 2006, 12(3))

    图3，显微镜下苏木精-伊红染色的回肠切片。可见绒毛严重变短，隐窝上皮变薄，坏死细胞增多。由于纤维素，蛋白类物质和红细胞的出现固有层变厚。整个小肠可见成段的坏死性肠炎病变（摘自Evermann, 兽医诊断研究杂志, 2005）

    图4，苏木精-伊红免疫组化染色显微镜下小肠切片：A，鼠抗CCV抗体染色，可见红染的CCV沿绒毛顶端分布于上皮细胞内，而未深入隐窝部分；B，阴性同型抗原对照，未见染色；C，鼠抗CPV抗体染色，隐窝扩张并有坏死的细胞屑片，但未见红染的CPV-2抗原（摘自Evermann, 兽医诊断研究杂志, 2005）

2.1  CCV可加剧其它病原引发的疾病
    CCV与其它传染病合并感染症状将更为严重甚至导致死亡。1988年Appell发现CCV可使随后发生的CPV-2的症状变得更为严重，死亡率显著增加（见表1）[13]。1999年Annamaria Pratelli等报道CPV-2b感染的幼犬在康复后15天再次发生严重的出血性肠炎并死亡，采用单克隆荧光抗体检测感细胞培养物证实为CCV感染。也有报道表明先前感染过CPV（2或2b）可增强动物对CCV的易感性或疾病的严重程度[14]。温海检出的8份CCV阳性病死犬样品中有5份是同其它病毒混合感染[7]。成都双流动物医院收治42例CCV阳性犬，其中合并CPV，CDV感染者分别死亡8例和1例，总死亡率为21.4%[2]。犬传染性呼吸道疾病虽然由多因素（如CPIV，CAV-2，博代氏杆菌等）导致，但实验感染上述任何单一病原只能引起轻度而非严重呼吸道疾病[5]。Erles研究发现犬只进入收容所时若血清中存在CCV抗体，则其后发展为呼吸道疾病的风险将降低，但单独的CCV感染仅可能引起轻微或亚临床的呼吸系统症状，合并感染则可出现严重的呼吸系统疾病[15]。说明CCV增加合并感染的风险并不仅限于胃肠道系统。除并发CPV，CDV等感染外， CCV也可合并CAV-1感染，表现出严重的肠炎症状、白细胞减少、呼吸困难和脱水，症状出现7-8天后幼犬死亡[16]。因此CCV的出现会加剧其它病原引发的疾病。


3 犬冠状病毒病的发病机理
    CCV一般通过粪口途径感染。潜伏时间较短，自然感染一般为1-4天，实验感染犬仅为24-48小时。通常感染后约3-14天都可能从粪便分离到CCV病毒。多数犬感染后8-10天症状消失，但仍可能继续排毒。
    感染后CCV从肠腔侵入小肠绒毛成熟上皮细胞，并主要在肠绒毛上2/3的柱状上皮快速复制或在胞浆囊泡内蓄积。通过激发细胞溶解酶，导致绒毛脱落和变短，从而引起分泌乳糖酶和蛋白酶能力显著下降
，水、电解质等因吸收减少而被滞留在肠管中。乳糖等营养成分的积蓄造成渗透性水潴留，导致腹泻，脱水等症状，导致正常的肠道结构和功能破坏（见图5A）。成熟病毒颗粒通过囊泡顶端质膜或被感染细胞质膜溶解而释放到外部环境而引起排毒。最终结果是被感染细胞越来越快地从绒毛上脱落，而被加速增殖的下层隐窝上皮（未成熟细胞）替代，但绒毛坏死和出血很少，因此多数情况下单纯的CCV仅表现轻微临床症状。

    图5，A，正常的肠绒毛，下端隐窝细胞沿绒毛逐步分化为有吸收功能的成熟细胞；B，感染CPV后隐窝上皮细胞受损，黏膜萎陷，肠道分泌和吸收功能明显下降（摘自Greene.犬猫传染病学（第三版））
    如果出现其它病原体的合并感染（如CPV、CAV-1、产气荚膜杆菌、弯曲杆菌、沙门氏菌等）则可加重临床表现。以继发CPV感染为例， CPV感染后仅在快速分化的细胞上复制，先在淋巴组织，后在肠道隐窝上皮复制（病变见图5B）。感染CCV时为弥补小肠绒毛上皮的损伤，扁平的隐窝上皮细胞快速分裂以修补肠绒毛上皮。这种加速增殖的隐窝上皮细胞为CPV提供了良好复制场所。因此CPV，CCV并发感染，其临床症状的严重程度要远高于任一病原体单独感染（见图6），由此可看出预防CCV和预防CPV一样重要[8]。

    图6，CCV合并CPV感染后，肠道分泌和吸收功能几乎完全丧失，犬只死亡率大大增加

4 CCV的免疫机理
    关于CCV的免疫机理目前还不是特别清楚，但一般认为肠道分泌的黏膜抗体起重要作用。CCV进入肠腔后被派伊尔淋巴集结（Peyer’s patches）圆顶上皮的M细胞摄入，随后被转移至下层淋巴组织15。接种后CCV抗原通过刺激机体初次免疫应答产生少量血浆抗体，同时在肠道内形成免疫记忆细胞。再次接触CCV后则刺激肠道产生抗CCV的IgA等抗体。后者与肠道中的CCV结合形成免疫复合物，阻止病毒进一步进入肠上皮而发挥免疫保护作用。感染犬十二指肠分泌物中已检测到所有三种抗CCV免疫球蛋白,
其中IgG和IgA水平的增加明显与患犬停止排毒同步[15]。
    临床兽医常习惯于以血清抗体滴度高低作为免疫保护能力高下的评估指标，但CCV不完全一样。因为CCV感染主要局限于肠道，循环抗体对于CCV引起的肠炎作用不明显。这也是有人觉得接种CCV疫苗意义不大的原因之一。冠状病毒感染引起的哺乳仔猪传染性胃肠炎（TGEV）研究表明分泌性IgA与免疫保护有很大相关性, 提示肠道局部免疫的产生和/或局部及全身细胞介导免疫的产生在控制此类感染方面比循环抗体更重要[15]。因此CCV血清抗体滴度仅作为疫苗效力或者判断是否被感染的参考，而不能作为CCV疫苗保护能力的直接指标[17]。

    图7，接受CCV攻毒后免疫犬（试验组）和未免疫犬（对照组）粪便中IgA量比较（注:OD值为入射光和透射光强度比的常用对数值，可用于检测部分溶液浓度）。攻毒后7天免疫组肠道分泌的IgA明显高于对照组
    表2， 接种CCV灭活疫苗和口服攻毒后疫苗对肠道的保护

5 犬冠状病毒病的预防
    目前已有犬冠状病毒疫苗，这些产品如勃林格殷格翰的犬四联+莱姆 + 四价钩体疫苗[a]；梅里亚的基因重组犬细小+冠状疫苗[b]-默沙东的犬四联+二价钩体+冠状疫苗[c]，硕腾的卫佳捌[d]等。根据某些疫苗生产商的资料显示疫苗接种后7天可显著升高粪便中抗CCV的IgA水平（图7）[18]。通过比较对照组血清学和免疫荧光抗体检查结果，免疫组血清抗体显著增加，肠道组织免疫荧光抗体检查未见CCV感染，但未免疫组血清抗体未见阳转，肠道出现不同程度的免疫荧光反应（表2）[18]。证实接种该疫苗可大大阻止CCV入侵肠上皮的可能性而起到预防和保护作用。
    临床兽医多数通过临床症状和/或指标来判断动物是否患病或健康（得到保护）CCV感染。单一性感染当其临床症状轻微时，临床医生从表观上很难看出动物是否患病，同样也很难区分具有轻微CCV症状的动物与得到疫苗保护的健康动物。看不出两者明显差异可能是临床医生对犬冠状病毒预防有些争议的根本所在。

脚注
a Duramune Lyme® + Max 5-CvK/4L, Boehringer-Ingelheim, Germany.
b RECOMBITEK® Canine Parvo + Corona-MLV, Merial, France
c Nobivac Canine 1-DAPPvL2+Cv, MSD, America.
d Vanguard Plus5 CVL, Zoetis, America.

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