犬C反应蛋白研究进展

    C反应蛋白（C-Reactive Protein，CRP）是一种急性期反应蛋白，早在1930年被发现[1]。机体在受到外源性刺激（感染、创伤等）时，会引起一些促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-α）释放，促进肝脏合成CRP[2, 3]。由于CRP的变化非常灵敏，影响因素较少，因此广泛用于临床。

1.急性期反应蛋白（Acute Phase Protein，APPs）
    机体在受到创伤、感染等刺激时，会出现急性期反应，受到刺激的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞会释放IL-1、IL-6、TNF等促炎因子，促进肝脏合成急性期反应蛋白[2, 3]。常见的急性期反应蛋白包括CRP、结合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）、淀粉样蛋白（serum amyloid A，SAA）、a1酸性糖蛋白（a1 acid glycoprotein，AGP）、纤维蛋白原（Fibrinogen，FIB）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）等，不同物种的急性期反应蛋白略有不同（详见表1）[3]。犬的急性期反应蛋白中，CRP是最主要的APP，SAA的变化也比较显著[2-4]。急性期反应蛋白的主要功能包括感染和炎症的免疫调节、损伤组织的修复等，是一种固有免疫反应，但不同APPs的功能不尽相同[2-4]。
    表1 常见家养动物主要的急性期反应蛋白[3]

    MAP，Major acute phase protein
    摘自Acute phase proteins: Biomarkers of infection and inflammation in veterinary medicine[3]
    CRP是一种穿孔蛋白，可见于脊椎动物和无脊椎动物，呈平面五角形排列[5]。人的CRP的五个亚单位均未被糖基化，而犬的CRP有两个亚单位被糖基化，分子量为100 K Dal[6]。CRP的主要作用为通过识别潜在的有害异体分子，重建补体系统，提供非特异性固有免疫[2-4]。它可以与细菌或真菌表面的磷脂结合，发挥嗜中性粒细胞和巨噬细胞的趋化作用；还可以与细菌的补体结合，促进巨噬细胞吞噬细菌[2-4]；甚至作为微生物细胞膜的早期抗体，促进机体的免疫反应[2]；CRP可识别并清除凋亡、坏死或受损的宿主细胞，促进机体组织结构重建和功能恢复；它还可以清除一些分子或机体的一些内源性结构，抑制自体免疫反应[2]。

2.CRP的研究历史
    1930年，Tillet和Francis发现肺炎球菌表面的C多糖在有钙离子的情况下，能发生沉淀反应，当时研究者把其称为C片段（C Fraction），认为其并非蛋白质[1]；1940年，Colin和Oswald等的研究证实发生沉降的物质是一种蛋白质，由于该蛋白能和C多糖发生沉淀反应，因此被称为C反应蛋白，CRP）[7]；1947年，Maclyn等首次成功结晶纯化出人的CRP [8]；1950年，McCarty首次报道了使用CRP监测风湿患者病情的临床研究[9]。
    犬的CRP于1960年左右才开始受到关注，1970年被成功分离，1972年研究者利用特异性抗体定量检测CRP的浓度[2-4]；但一直到20世纪90年代，CRP才得到全面的研究[6, 10, 11]；1998年，日本便研制了商用仪器设备和试剂来检测犬的CRP，随后20多年里，在日本的诊疗工作中，CRP起着非常重要的作用[2-4]。

3.CRP的代谢
    CRP是机体受到刺激后迅速产生的一种反应，刺激引起促炎因子（主要为IL-1、IL-6等）释放，然后与肝脏细胞上的相关受体结合，在核转录因子的作用下，促进CRP的产生。机体在受到刺激4小时后CRP就有可能会升高，但临床检测可能显示12小时后才会明显升高。犬CRP的半衰期约为16小时，单次刺激后24小时达到峰值，随后迅速下降[2-4]。长期慢性感染病例也会出现CRP明显升高的现象[3, 4]。

    图1血清中不同急性期反应蛋白（APPs）的浓度和变化。CRP是人和犬的主要急性期反应蛋白。Major代表最主要的APP，Intermediate代表升高较为明显的次要APP，Minor代表轻微升高的微量APP，而Negative为负急性期反应蛋白，在急性期反应中其浓度会下降[12]。

4. CRP的检测方法
    在血清蛋白电泳中，APPs主要分布于α和β球蛋白区，因此，通过蛋白电泳，可以粗略评估APPs的变化，但对特异性APP的敏感性很低[2, 3]。为了解决这一问题，近三十年来，研究者探索出了很多种CRP的检测方法，主要包括以下方法：乳胶凝集法、免疫比浊法（已用于临床）、激光放射免疫比浊法、ELISA、化学发光法、荧光免疫法、免疫层析法等[2-4, 13-16]。在这些检测方法中，乳胶凝集法是一种半定量检测法，目前已基本淘汰；而ELISA是全球应用最为广泛的方法，但试验流程繁琐，灵敏度极高，能检测出极低浓度的CRP，然而极低浓度CRP的临床意义有限；由于犬和人的CRP结构不同，具有种属特异性，因此，若采用免疫学方法检测，不能用人的试剂[11, 13-16]；荧光免疫法可用于测量全血、唾液或渗出液中的CRP，但应用不广泛；免疫层析法操作较为简单，目前已被商品化，采用犬CRP的多克隆抗体测量犬CRP的方法，操作极为简单，结果不受脂血症和溶血黄疸的影响，适合临床应用[2-4, 14]。

5. 犬CRP的临床应用
    犬CRP是急性期反应中最主要的APP，是机体固有免疫反应的一种，并非某种感染的特异性反应，因此，在感染性疾病、创伤、肿瘤等疾病中均有可能明显升高，可以作为这些疾病的一种指征。另外，CRP的影响因素较少，应激、怀孕等仅能引起CRP轻微升高，比白细胞更灵敏，随着检测技术的进步，临床应用越来越广泛[2,
3]。

5.1 健康犬的CRP
    健康犬血清中的CRP浓度很低，不同的研究显示，健康犬的血清CRP浓度小于5 mg/L。曾有调查显示怀孕母犬的CRP可能会轻度升高，而Ulutas等跟踪了60例母犬的整个发情期和怀孕期，分别监测了其血清CRP、SAA、Hp、CP、FIB浓度，结果显示整个发情周期里，同种APP并无明显变化，但怀孕母犬的CRP、Hp、CP和FIB均轻度升高[17]

5.2 CRP在感染性疾病中的应用

5.2.1 细菌感染  
    严重的全身或系统感染会引起CRP严重升高（20倍），尤其是子宫蓄脓病例[2, 3, 12, 18]。Jitpean等于2014年的报道显示，31例子宫积脓患犬的CRP和SAA均显著升高，其中CRP升高约40倍，而SAA升高约10倍，而血清IGF-1和Fe均显著下降[18]。Dabrowski等于2013年的研究显示，开放性子宫积脓和闭合性子宫积脓病例的外周血及子宫动脉血中的CRP、SAA、HP均显著升高[19]。Viitanen等于2014年的报道显示，细菌性支气管肺炎和细菌性肺炎患犬的血清CRP也显著升高（10倍），而慢性支气管炎、嗜酸性粒细胞性支气管炎患犬的CRP多处于参考范围内，或轻微升高[20]。还有一些报道显示其他全身性败血性疾病中CRP也会显著升高，死亡病例生前血清CRP居高不下，这些研究均表明CRP可用于犬感染性疾病的诊断和治疗监测[3, 21]。

5.2.2 病毒感染  
    目前关于犬病毒感染和CRP关系的研究相对较少。有文献显示，细小病毒感染犬的CRP也会显著升高（10倍），McClure等于2013年的研究显示，CPV患犬12h和24h时的血清CRP浓度和死亡率正相关，和存活时间负相关，但CRP不能作为CPV预后的唯一指标[22]。5.2.3血液寄生虫感染血液寄生虫感染患犬的血清CRP也会升高。Venco等于2014年的报道显示，心丝虫感染患犬若出现肺动脉高压或动脉内膜炎，其血清CRP浓度也会明显升高（5倍），可以作为心丝虫感染中动脉内膜炎和肺动脉高压的指征[23]。Matijatko等于2007年的报道显示，犬巴贝斯虫感染病例的血清CRP可升高30倍以上，严重者甚至达800倍，其灵敏度远高于白细胞，且可用于治疗监测[24]。

5.3 CRP在创伤性疾病中的应用
    犬的CRP创伤时也会升高，在外科手术中尤为明显。Kjelgaard-Hansen等于2013年的研究显示，24只进行生理性去势或绝育的犬根据手术分为三组，一组为输精管结扎，一组为腹腔镜下子宫卵巢切除术（ovariohysterectomy，OHV），一组为开腹OHV，结果显示，三组犬的CRP在术后4小时均逐渐升高，至24小时达到峰值，随后逐渐下降，但在升高程度方面，输精管结扎<腹腔镜下OHV <开腹OHV[4]。

5.4 CRP在肿瘤疾病中的应用
    犬的肿瘤疾病也可能会引起CRP升高，尤其是恶性肿瘤。恶性肿瘤生长很快，体积较大，肿瘤本身会释放一些炎性因子，肿瘤坏死引起的炎症反应也会释放促炎因子，最终导致CRP升高[2, 3]。Planellas等于2009年的报道显示，乳腺良性腺瘤患犬的血清CRP可能会轻度升高，而乳腺癌患犬的CRP会明显升高（2倍）[25]；Mischke等于年的报道则显示，淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病患犬的CRP均显著升高（5 ~ 10倍），虽然并非诊断唯一指标，但可作为预后指标[26]；Chase等于2012年的报道显示，肥大细胞瘤患犬的血清CRP和AGP升高，而SAA下降，肉瘤患犬中，CRP、SAA和AGP均升高[27]。
    综上所述，CRP是犬最主要的急性期反应蛋白，在发挥机体固有免疫反应方面起着积极的作用，在多种疾病中会出现显著的变化，是急性感染和炎症性疾病的一种生物标志物，在疾病的治疗监测和预后方面也起着非常重要的作用。

参考文献                                         
[1]  Tillett W S, Francis T.Serological reactions in pneumonia with a
non-protein somatic fraction ofpneumococcus. J Exp Med, 1930,52(4):561-571. [2] 
Ceron J J, Eckersall P D, Martynez-Subiela S.Acute phase proteins in dogs and
cats: current knowledge and futureperspectives. Vet Clin Pathol,
2005,34(2):85-99. [3]  Eckersall P D, Bell R. Acute phase proteins:Biomarkers of
infection and inflammation in veterinary medicine. Vet J,2010,185(1):23-27. [4] 
Kjelgaard-Hansen M, Strom H,Mikkelsen L F, et al. Canine serum C-reactive
protein as a quantitative markerof the inflammatory stimulus of aseptic elective
soft tissue surgery. Vet ClinPathol, 2013,42(3):342-345. [5]  Osmand A P,
Friedenson B,Gewurz H, et al. Characterization of C-reactive protein and the
complementsubcomponent C1t as homologous proteins displaying cyclic pentameric
symmetry(pentraxins). Proc Natl Acad Sci U S A, 1977,74(2):739-743. [6]  Caspi
D, Baltz M L, Snel F, et al. Isolationand characterization of C-reactive protein
from the dog. Immunology, 1984,53(2):307-313. [7]  Macleod C M, Avery O T.
Theoccurrence during acute infections of a protein not normally present in
theblood: II. Isolation and properties of the reactive protein. J Exp
Med,1941,73(2):183-190. [8]  McCarty M. The occurrence during acute infectionsof
a protein not normally present in the blood: IV. Crystalization of theC-reactive
protein. J Exp Med, 1947,85(5):491-498. [9]  Anderson H C, Mccarty
M.Determination of C-reactive protein in the blood as a measure of the
activityof the disease process in acute rheumatic fever. Am J Med,
1950,8(4):445-455.[10]  Gabay C, Porter B, Guenette D,et al. Interleukin-4
(IL-4) and IL-13 enhance the effect of IL-1beta onproduction of IL-1 receptor
antagonist by human primary hepatocytes andhepatoma HepG2 cells: differential
effect on C-reactive protein production.Blood, 1999,93(4):1299-1307.[11] 
YamamotoS, Tagata K, Nagahata H, et al. Isolation of canine C-reactive protein
andcharacterization of its properties. Vet Immunol Immunopathol,
1992,30(4):329-339.[12]  GabayC, Kushner I. Acute-phase proteins and other
systemic responses toinflammation. N Engl J Med, 1999,340(6):448-454.[13] 
EnginlerS O, Ates A, Diren S B, et al. Measurement of C-reactive protein
andprostaglandin F2alpha metabolite concentrations in differentiation of
caninepyometra and cystic endometrial hyperplasia/mucometra. Reprod Domest
Anim,2014,49(4):641-647.[14]  HillstromA, Hagman R, Tvedten H, et al. Validation
of a commercially available automatedcanine-specific immunoturbidimetric method
for measuring canine C-reactiveprotein. Vet Clin Pathol, 2014,43(2):235-243.[15]
 Kjelgaard-HansenM, Stadler M, Jensen A L. Canine serum C-reactive protein
detected by means ofa near-patient test for human C-reactive protein. J Small
Anim Pract,2008,49(6):282-286.[16]  YamamotoS, Shida T, Okimura T, et al.
Determination of C-reactive protein in serum andplasma from healthy dogs and
dogs with pneumonia by ELISA and slide reversedpassive latex agglutination test.
Vet Q, 1994,16(2):74-77.[17]  Ulutas P A, Musal B, Kiral F,et al. Acute phase
protein levels in pregnancy and oestrus cycle in bitches.Res Vet Sci,
2009,86(3):373-376.[18]  Jitpean S, Holst B S, Hoglund OV, et al. Serum
insulin-like growth factor-I, iron, C-reactive protein, andserum amyloid A for
prediction of outcome in dogs with pyometra.Theriogenology,
2014,82(1):43-48.[19]  Dabrowski R, Kostro K,Szczubial M. Concentrations of
C-reactive protein, serum amyloid A, andhaptoglobin in uterine arterial and
peripheral blood in bitches with pyometra.Theriogenology,
2013,80(5):494-497.[20]  ViitanenS J, Laurila H P, Lilja-Maula L I, et al. Serum
C-reactive protein as adiagnostic biomarker in dogs with bacterial respiratory
diseases. J Vet InternMed, 2014,28(1):84-91.[21]  Nakamura M, Takahashi M,
OhnoK, et al. C-reactive protein concentration in dogs with various diseases. J
VetMed Sci, 2008,70(2):127-131.[22]  McClureV, van Schoor M, Thompson P N, et
al. Evaluation of the use of serum C-reactiveprotein concentration to predict
outcome in puppies infected with canineparvovirus. J Am Vet Med Assoc,
2013,243(3):361-366.[23]  Venco L, Bertazzolo W, GiordanoG, et al. Evaluation of
C-reactive protein as a clinical biomarker in naturallyheartworm-infected dogs:
a field study. Vet Parasitol, 2014,206(1-2):48-54.[24]  MatijatkoV, Mrljak V,
Kis I, et al. Evidence of an acute phase response in dogsnaturally infected with
Babesia canis. Vet Parasitol, 2007,144(3-4):242-250.[25]  Planellas M, Bassols
A,Siracusa C, et al. Evaluation of serum haptoglobin and C-reactive protein
indogs with mammary tumors. Vet Clin Pathol, 2009,38(3):348-352.[26]  MischkeR,
Waterston M, Eckersall P D. Changes in C-reactive protein and haptoglobin indogs
with lymphatic neoplasia. Vet J, 2007,174(1):188-192.[27]  Chase D, McLauchlan
G,Eckersall P D, et al. Acute phase protein levels in dogs with mast cell
tumoursand sarcomas. Vet Rec, 2012,170(25):648.